ELISA ，一种酶联免疫吸附测定法，是一种基于分析板的生化免疫测定法。它广泛应用于生命科学和生物化学实验室，用于生物分子的定量，例如蛋白质、抗体、肽、糖蛋白和激素。

该技术利用抗原和抗体之间的相互作用来产生可测量的结果。抗原是一种启动免疫反应的外来蛋白质，其中可能包括与抗体复合后的一系列反应。抗体是生物体免疫系统产生的蛋白质。 ELISA 测定中涉及的两种抗体是一抗和二抗。关于抗原和抗体可以参考《 免疫学检测：一抗和二抗简介 》

在该技术中，抗原被固定在 ELISA 板的表面，然后与酶缀合物抗原特异性抗体一起孵育。这导致抗原 - 抗体复合物的形成。然后使用特定底物和合适的检测方法，通过孵育含有抗原 - 抗体复合物的 ELISA 板来检测反应产物。

在实验室遵循的通用 ELISA 方案包括以下步骤：

1 、抗原固定在 ELISA 板的表面。

2 、使用封闭缓冲液覆盖板的其余部分。

3 、 ELISA 板与抗原在室温下孵育抗原特异性抗体。

4 、使用读板器测量反应产物或获得的信号。

ELISA 的最后一步是将含有反应混合物的 ELISA 板与合适的底物一起孵育。底物的使用取决于您使用的检测方法，并与抗体酶联，例如辣根过氧化物酶 (HRP) 、β - 半乳糖苷酶和碱性磷酸酶 (AP) 。这有助于信号放大和板中发生的反应的可视化。

ELISA 应用中常用的一些底物是过氧化氢、鲁米诺和对硝基苯磷酸盐（ pNPP 底物）。

在本文中，上海AG九游会生物将介绍这些底物在 ELISA 测定过程中的工作原理、它们的功能以及它们在不同医疗和生物技术实验室和行业中的应用。

ELISA 底物如何工作？

ELISA 底物通过与缀合的酶结合来检测测定中使用的抗体。该酶将底物转化为有色产物或荧光或电化学信号，使用分光光度计、分光荧光计或电化学装置获取其吸光度或读数，以定量给定样品中的抗原。

不同的底物在与酶的氧化反应过程中产生不同的颜色。例如，辣根过氧化物酶底物与 HRP 酶反应后产生以下结果：

1、 ABTS （ 2,2 ′ -Azinobis[3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ]- 二铵盐）：绿色

2、 TMB （ 3,3 ′ ,5,5 ′ - 四甲基联苯胺）：橙色

3、 OPD （邻苯二胺）：蓝色

产生的颜色量或获得的信号量与与固定在 96 孔板表面的抗原结合的一抗的量成正比。

图： HRP 酶与其底物之间抗原抗体复合物形成和氧化反应的图示

获得高质量、一致、可靠的蛋白质测量结果。如今，研究人员使用 ELISA 试剂盒。这些检测试剂盒配备了运行特定 ELISA 检测所需的所有合适试剂。它们执行起来既简单又快捷。此外，它们具有最低的测定间和测定内变异性、高灵敏度和最高可能的批次间一致性。

市场上还有一些底物试剂盒，配有适合 ELISA 检测步骤的酶 - 底物试剂配方。它们使这个过程更快更容易。

ELISA 底物类型

根据所使用的检测方法， ELISA 底物分为以下几类：

化学发光底物

报告酶 - 底物反应中产生的光用作化学发光检测系统的信号。用于 HRP 酶的化学发光底物溶液包括鲁米诺。 AP 酶需要基于 1,2- 二氧杂环丁烷的试剂来产生 X 射线胶片或电荷耦合器件 (CCD) 相机捕获的信号。

为了提高化学发光信号的强度、持续时间和灵敏度，检测过程中还使用了增强化学发光底物 (ECL) 。然而，应稀释底物以防止错误的高强度信号。

显色底物

这些底物与报告酶反应产生有色的不溶性反应产物，并使用分光光度计进行检测。该方法中使用的 HRP 底物包括 2'- 嗪双 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 )(ABTS) ； 5- 氨基水杨酸（ 5-AS ）； 3,3',5,5'- 四甲基联苯胺 (TMB) ；和邻苯二胺（ OPD ）。

AP 酶的底物是 5- 溴 -4- 氯吲哚基磷酸盐 (BCIP) 和硝基蓝四唑 (NBT) 。通过使用终止溶液可以增强所得的比色信号，以获得更准确的信号测量。

图：显色检测方法的机制说明

荧光底物

荧光 ELISA 底物需要荧光计能够产生正确的激发光束，以便荧光标签发出信号。荧光计通过其激发和发射滤光片测量信号。

ELISA 测定中使用的荧光 AP 底物是 4-MUP （ 4- 甲基伞形磷酸酯），它在 440 nm 的发射波长和 360 nm 的激发波长处产生信号。 HPPA （ 3- 对羟基苯基丙酸）和 HPA （羟基苯基乙酸）底物与过氧化物酶配对。

图：荧光检测机制的图示。

为您的 ELISA 测定选择合适的底物取决于灵敏度（较低或较高的检测限）、时间要求以及过程中需要 / 使用的检测设备的类型。

ELISA 底物有何用途？

ELISA 底物对于 ELISA 测定中获得的信号的检测、放大和定量至关重要。它们与酶发生反应，产生有色产物或信号，并使用合适的设备进行测量。

ELISA 检测

ELISA 是一种用于识别和定量生物分子（例如蛋白质、肽、糖蛋白和激素）的生化测定法。 ELISA 的最后一步是对含有抗原抗体（与荧光团或酶结合）复合物的反应混合物以及用于反应可视化的合适底物进行孵育的 ELISA 板。

底物与 HRP 或 AP 酶反应，产生不溶性有色反应产物或信号，由仪器、分光光度计或分光荧光计进行测量。

哪些行业使用 ELISA 底物？

HRP 和 AP 是两种最常用的酶，用于在 ELISA 检测中结合抗体来检测抗原。这主要是因为它们的简单性和高灵敏度。

在测定中，它们与合适的底物发生反应，产生用于抗原分析的可测量信号。因此， ELISA 底物是 ELISA 方案的关键组成部分之一，并用于许多不同的实验室和行业。

制药

制药行业使用 ELISA 测试来检测多种疾病，例如流感、艾滋病毒、登革热和莱姆病。市场上还有一些 ELISA 试剂盒，可以使工作流程更快、更轻松。

此外， ELISA 测定在疫苗开发中也至关重要。它们检测针对故意注射到宿主体内的抗原而形成的抗体。

食品工业

在食品工业中， ELISA 检测用于检测制成品中的食品过敏原，特别是涉及牛奶、杏仁、花生、核桃和鸡蛋。它可以防止食品中的欺诈性替代品并证明其在市场上的真实性。